Генетика бактерий. Наследственный аппарат бактерий

Современная биология и генетика обязаны своими выдающимися достижениями микробиологии, которая предоставила им микроорганизмы в качестве экспериментальных объектов. Важность и актуальность исследований в области генетики микроорганизмов заключается прежде всего в том, что они впервые создали методы управления наследственностью.

В 1865 году чешский ученый Грегор Мендель открыл существование генов как дискретных единиц наследственности. В 1928 году Ф. Гриффитс впервые осуществил трансформацию невирулентных пневмококков в вирулентные. Он заразил белых мышей смесью бактерий, состоящей из убитых нагреванием, следовательно, потерявших вирулентность капсульных пневмококков и живых бескапсульных невирулентных пневмококков. В контрольных опытах эти группы бактерий, введенные порознь, мышей не убивали. Однако в опытной группе мыши погибли и из крови их были выделены живые пневмококки, приобретшие капсулу убитых пневмококков. Следовательно, убитые капсульные пневмококки содержали вещество, способное передать признак капсулообразования (вирулентности) живым пневмококкам. Механизм трансформации оставался неизвестным.

В 1953 году Ф. Крик и Д. Уотсон определили структуру гена, основанную на двойной спирали ДНК. Это открытие показало, каким образом ген выполняет свои три важнейшие функции:

• 1) непрерывность наследственности - полуконсервативным механизмом репликации ДНК;
• 2) управление структурами и функциями организма - с помощью генетического кода, использующего запас всего из четырех оснований (букв) - аденин (А), тимин (Т), гуанин (Г), цитозин (Ц);
• 3) эволюцию организмов благодаря мутациям и генетическим рекомбинациям.

Работами Ф. Крика, С. Бреннера, М. Ниренберга, С. Очоа, X. Кораны с использованием микробных объектов к 1966 г. генетический код был расшифрован, показана его триплетность, неперекрываемость и универсальность для всех живых организмов.

Ученые оценили удобство работы с бактериями и вирусами, обусловленное их свойствами: коротким периодом генерации, быстрым накоплением популяций с огромным количеством особей, простотой культивирования и использования. На бактериальных объектах были открыты информационные, рибосомальные, транспортные РНК и установлен механизм синтеза белка. Д. Ледерберг и Э. Татум открыли у бактерий конъюгацию, В. Хейс - плазмиду, определяющую половую полярность бактерий. Ф. Жакобом и Э. Вольманом создано учение о плазмидах. Разработанная на модели кишечной палочки Ф. Жакобом и Ж. Моно концепция оперона стала универсальной концепцией генетического контроля экспрессии генов.

В 1972 году возникла и бурно развивается генная инженерия. Ключевое значение для ее возникновения и управления наследственностью имело обнаружение в 1970 г. Г. Теминым, С. Мизутани, Д. Балтимором у некоторых онкогенных вирусов фермента - обратной транскриптазы (ревертаза, РНК-зависимая ДНК-полимераза). Это позволило получать на матрице информационной РНК копийный ДНК-ген и использовать его в генной инженерии. В биотехнологии, основанной на генной инженерии, широко используются бактериальные ферменты, плазмидные и вирусные векторы, а также бактерии как основные продуценты биологических продуктов.

Прокариоты (бактерии) имеют морфологически обособленные клеточные структуры, содержащие генетическую информацию, - ну- клеоиды. Нуклеоид состоит из одной свернутой в клубок хромосомы, которая свободно располагается в цитоплазме, но связана с определенными рецепторами на цитоплазматической мембране. Поэтому бактериальная клетка в отличие от эукариот гаплоидна, т.е. содержит один набор генов.

В некоторых условиях клетки бактерий могут содержать совершенно идентичные по набору генов копии хромосомы, и бактерии остаются гаплоидными. В отличие от всех других организмов бактерии обладают уникальным свойством изменять массу своей ДНК, регулируя в зависимости от условий обитания содержание копий своих генов, эквивалентно массе 2, 4, 6, 8 хромосом. Это позволяет им регулировать скорость собственного размножения - одно из главных условий, обеспечивающих выживание бактерий в окружающей среде, а следовательно, и сохранение вида в природе.

Бактериальная хромосома представляет собой двухцепочечную молекулу ДНК (кольцевую хромосому), содержащую гены, расположенные в линейном порядке. Поскольку длина хромосомы (у Е. coli около 1000 мкм) во много раз превышает длину бактерии (1,5-3,0 мкм в среднем), хромосома компактно упакована в суперспирализованной форме в виде 12-80 петель, связанных с сердцевинной структурой, представленной особым классом РНК - 4,5 S РНК. Геном (вся совокупность нуклеотидов, содержащихся в хромосоме у данного индивидуума) и генотип (вся совокупность индивидуальных генов у данного индивидуума) у бактерий не однозначны, но близки, так как большинство генов содержатся в хромосоме в единственном числе, в отличие от эукариот, содержащих до 30-50% повторяющихся последовательностей нуклеотидов в геноме. Поэтому размеры геномов у бактерий, вирусов, плазмид выражают либо в молекулярной массе, либо количеством нуклеотидных пар геномной нуклеиновой кислоты, либо количеством генов. Эти значения сопоставимы, так как в среднем каждый ген состоит из 1000 пар нуклеотидов, а масса одного нуклеотида ДНК - 500 дальтон. Так, хромосома Е. coli имеет молекулярную массу 2,8 х ю 9 дальтон, количество нуклеотидных пар 3,8 х Ю 6 и содержит 2500-3000 генов.

Хромосома бактерии состоит из двух типов генов: структурных (цистронов), кодирующих синтез определенной полипептидной цепи, и регуляторных (или акцепторных), регулирующих активность генов (регуляторы, операторы, промоторы, аттенуаторы, терминаторы идр.). Основной структурно-функциональной единицей хромосомы является оперон. Это группа структурных генов-цистронов, физически сцепленных друг с другом и с геном-оператором, который управляет их выражением. В свою очередь оперон или их группа находится под управлением одного гена-регулятора, что представляет более сложную структурно-функциональную единицу - регулон.

Гены в хромосоме располагаются линейно, поэтому можно изучать их последовательность и составлять хромосомную (генетическую) карту. Для этого изучают время переноса соответствующих генов при конъюгации бактерий. Локализацию генов на хромосоме определяют в минутах их переноса, в частности у кишечной палочки - от 0 до 100 мин.

В настоящее время основным методом изучения организации геномов живых организмов является секвенирование - определение последовательности расположения нуклеотидов в составе ДНК генов. Предварительно с помощью методики клонирования получают большое количество необходимых фрагментов ДНК. Уже полностью изучена нуклеотидная последовательность ДНК хромосом 20 важнейших бактерий (К pest is, Е. coli, Р. aeruginosa и др.).

Некоторые гены и группы генов хромосомы бактерий и плазмид бактерий относятся к транспонируемым генетическим элементам, т.е. генетическим структурам, способным в интактной форме перемещаться внутри данного генома или переходить от одного генома к другому, например, от плазмидного к бактериальному и наоборот. Транспонируемые генетические элементы представлены IS-элементами и транспозонами. IS-элементы, или вставочные последовательности (от англ, insertion sequence), имеют обычно небольшие размеры, не превышающие двух тысяч пар оснований. Они несут только один ген, кодирующий белок транспозазу, с помощью которой IS-элементы встраиваются в различные участки хромосомы. Их обозначают: IS 1, IS2, IS3 и т.д. Транспозоны (Тп) представляют собой более крупные сегменты ДНК, фланкированные инвертированными IS-элементами. Помимо генов, обеспечивающих их транспозицию, они содержат другие различные гены. Внутри крупного транспозона могут находиться более мелкие транспозоны.

Транспозоны способны встраиваться в различные участки хромосомы или переходить от одного генома в другой. Очень часто транспозоны содержатся в составе R-плазмид. Транспозоны обнаружены в составе геномов бактерий, плазмид, вирусов, эукариот. Им принадлежит важная роль в изменчивости и эволюции живой материи. Обозначают транспозоны порядковым номером: Тп1, Тп2, ТпЗ и т.д.

Все известные плазмиды представляют собой небольшие, ковалентно-замкнутые в кольцо суперспирализованные молекулы двунитевой ДНК, размеры которых варьируют от 1,5 до 200 МД (от 1500 до 400 000 пар нуклеотидов). Чем больше молекулярная масса, тем сложнее набор генов и многообразнее функции плазмид. Плазмиды содержат гены саморепликации; гены, контролирующие самоперенос или мобилизацию на перенос; другие гены, определяющие специфические функции самой плазмиды. Например, F-плазмиды определяют донорские функции клетки и способность ее к конъюгации; Ent-плазмиды - синтез энтеротоксинов; биодеградативные плазмиды - разрушение различных органических и неорганических соединений.

Для плазмид характерны следующие свойства:

• саморегулируемая репликация;
• явление поверхностного исключения (механизм, который не позволяет проникнуть в клетку, уже содержащую плазмиду, другой, родственной ей, плазмиде);
• явление несовместимости (две близкородственные плазмиды не могут стабильно сосуществовать в одной клетке, одна из них подвергается удалению);
• контроль числа копий плазмиды на хромосому клетки (различают малокопийные - 1-4 копии и многокопийные - от 12 до 38 копий плазмиды);
• контроль стабильного сохранения плазмид в клетке-хозяине;
• контроль равномерного распределения дочерних плазмид в дочерние бактериальные клетки;
• способность к самопереносу (у конъюгативных плазмид);
• способность к мобилизации на перенос (у неконъюгативных плазмид);
• способность наделять клетку-хозяина дополнительными важными биологическими свойствами, способствующими выживанию бактерий и плазмид в природе.

Плазмиды распространяются среди бактерий двумя способами: по вертикали - путем передачи от родительской клетки дочерним клеткам в процессе клеточного деления бактерий; по горизонтали - путем переноса между клетками в популяции бактерий независимо от клеточного деления. Перенос плазмид между бактериальными клетками осуществляется по механизму самопереноса путем конъюгации, контролируемой tra-опероном плазмиды. В зависимости от наличия этого оперона плазмиды подразделяют на конъюгативные и неконъю- гативные. Возможны также другие механизмы переноса плазмид (мобилизации на перенос неконъюгативных плазмид с помощью конъю- гативных плазмид, трансформации, трансдукции).

Классификация плазмид основана на их уникальном свойстве несовместимости, т.е. неспособности родственных плазмид стабильно сосуществовать в одной клетке. Она проявляется после проникновения плазмиды в клетку, уже содержащую близкородственную ей плазмиду. Плазмиды, не совместимые друг с другом, но совместимые с другими, объединяются в одну Inc-группу. Например, у энтеробактерий обнаружены 39 Inc-групп плазмид. Плазмиды, относящиеся к одной Inc-группе, обладают многими общими признаками.

Плазмиды имеют важное медицинское значение, так как контролируют синтез различных факторов патогенности бактерий и их лекарственной резистентности. Общебиологическое значение плазмид состоит в том, что они являются уникальным средством самозащиты бактерий и благоприятствуют сохранению бактерий в природе.

Передача генетической информации потомству (вегетативная репликация ДНК) осуществляется у бактерий и плазмид по универсальному механизму - полуконсервативной репликацией ДНК. При этом дочерние клетки получают ДНК хромосомы, у которой одна нить родительская (консервативная), другая нить ДНК вновь синтезирована на ее матрице, что обеспечивает очень точную передачу генетической информации (наследственность). Вегетативная репликация ДНК у бактерий начинается со строго фиксированного сайта хромосомы (oriC), который распознается ферментами, инициирующими репликацию. Она носит полуконсервативный характер, идет одновременно в двух направлениях, заканчивается в строго фиксированной точке - terminus. Поскольку цепи ДНК антипараллельны (если одна нить начинается с 5-го конца, другая - с 3-го конца), а ДНК-полимераза Ш осуществляет синтез ДНК только в направлении 5-3, репликация происходит различно на каждой нити: на одной из расплетенных нитей («прямой», «лидерной») она идет непрерывно, а на другой («отстающей») ДНК-полимераза Ш должна возвращаться, чтобы наращивать нить тоже в направлении 5-3, прерывисто, через образование сегментов Оказаки длиной у бактерий около 1000 нуклеотидов.

Скорость репликации ДНК у Е. coli при 37 °С соответствует включению 2 х ю 3 пар нуклеотидов в 1 сек. В репликации ДНК участвует комплекс ферментов, образующих единую структуру - реплисому. Генетический контроль репликации ДНК осуществляет большая группа генов хромосомы.

Помимо вегетативного типа у бактерий имеются конъюгативный и репаративный типы репликации ДНК. Конъюгативная репликация происходит при конъюгативном способе обмена генетическим материалом и контролируется плазмидными генами (tra-оперон). При этом осуществляется достройка второй нити ДНК, комплементарной нити, передаваемой от донора реципиенту. Репаративная репликация служит механизмом устранения из ДНК структурных повреждений или происходит на заключительном этапе генетической рекомбинации. Она контролируется хромосомными и плазмидными генами.

Информация, содержащаяся в геноме бактерий, расшифровывается, материализуется и реализуется путем биосинтеза белка. Универсальности генетического кода соответствует универсальность его расшифровки и реализации (экспрессии). Однако биосинтез белка у бактерий имеет некоторые особенности на этапе транскрипции. Гены бактерий в отличие от генов эукариот и вирусов не содержат нитронов, поэтому у бактерий отсутствует процесс сплайсинга при синтезе мРНК. Сплайсинг РНК - процесс, при котором происходит вырезание интронов (некодирующих последовательностей у генов, имеющих интрон-экзонную структуру) из первичных РНК-транскриптов и сшивание экзонов, в результате которого образуется и затем транслируется зрелая мРНК. Отсутствие сплайсинга РНК у бактерий является естественным генетическим барьером в реализации генетической информации эукариот у бактерий (прокариот). Преодоление этого барьера привело к созданию генной инженерии на бактериальных объектах.

Генетическая информация реализуется микроорганизмами весьма «экономно», в соответствии с конкретными условиями их существования. «Работают» (экспрессируются) только гены, необходимые для обеспечения жизнеспособности клетки в данных условиях. Саморегуляция системы генетической информации обеспечивается наличием в ней помимо структурных генов, кодирующих белки и другие макромолекулы, особых последовательностей нуклеотидов (акцепторных или регуляторных генов), не имеющих кодирующих функций, но управляющих работой структурных генов. Как уже упоминалось, совокупность расположенных рядом структурных и регуляторных генов составляет оперон-единицу генетической регуляции. Классической моделью оперона является лактозный оперон. Рассмотрим на примере лактозного оперона кишечной палочки его устройство и способ регуляции активности структурных генов, кодирующих синтез ферментов, участвующих в усвоении лактозы.

Начинается оперон с «участка прикрепления белка-активатора» - продукта вышестоящего регулона (Сар-белка, без которого РНК-полимераза не может связаться с опероном и начать транскрипцию). Далее на хромосоме расположен промотор - участок распознавания РНК-полимеразой и прикрепления ее. Затем следует оператор - участок, с которым связывается особый тормозящий транскрипцию белок-регулятор. После оператора расположены последовательно структурные гены z, у, а, кодирующие соответственно синтез трех ферментов, участвующих в усвоении лактозы, - Я-галактозидазы, галактозидпермеазы, тиогалактозидтрансацетилазы. Заканчивается lac-оперон терминатором - небольшим участком ДНК, служащим стоп-сигналом, прекращающим продвижение РНК-полимеразы и транскрипцию оперона. Вне 1ас-оперона, на другом месте хромосомы находится особый ген-регулятор, кодирующий непрерывный синтез белка-регулятора. Когда в окружающей среде нет лактозы, белок- регулятор прикрепляется к оперону и как «шлагбаум» препятствует продвижению РНК-полимеразы от промотора к структурным генам, репрессируя транскрипцию и в итоге синтез ферментов. Лактоза, если она есть в питательной среде, связывается с белком-регулятором, ал- лостерически изменяет его конфигурацию, в результате чего белок-регулятор уже не может прикрепляться к оператору. В итоге «шлагбаум» открыт, РНК-полимераза транскрибирует структурные гены в соответствующие мРНК, на матрице которых синтезируются ферменты, усваивающие лактозу.

Таким образом, лактоза индуцирует синтез ферментов, нужных для ее усвоения. Такие ферменты называются адаптивными или индуктивными. Рассмотренный тип регуляции активности генов называется негативным, так как в основе его лежит репрессия оперона белком-регулятором. Есть два варианта этого типа регуляции: негативная индукция, которую мы рассмотрели, и негативная репрессия.

В последнем случае в исходном положении белок-регулятор не может связываться с оператором, и синтез ферментов идет, а при наличии эффектора, обычно конечного продукта действия анаболических ферментов, белок-регулятор под его воздействием связывается с оператором и синтез ферментов репрессируется. Кроме негативного известен еще позитивный тип генетической регуляции синтеза белка. Отличие его от негативного типа заключается в том, что белковый продукт гена-регулятора не запрещает транскрипцию оперона, а наоборот, активирует ее. Этот тип регуляции также встречается у бактерий в двух вариантах - позитивной индукции и позитивной репрессии. Например, ara-оперон, контролирующий усвоение арабинозы, работает у кишечной палочки по механизму позитивной индукции.

Проявление признаков живых организмов, контролируемых генотипом, зависит от условий существования организма. Совокупность признаков организма в конкретных условиях его существования называется фенотипом. В зависимости от условий микроорганизмы одного генотипа могут иметь различные фенотипы, так как реализуется различная часть генетической информации генотипа или реализация происходит в различном диапазоне нормы реакции генотипа. Смена фенотипов при смене условий существования организма называется модификацией. Иными словами, модификации - это фенотипические различия, вызываемые внешними факторами у одинаковых в наследственном отношении микроорганизмов.

Отличительными признаками модификации у бактерий являются (три «О»):

• определенность изменчивости (определенный фактор внешней среды, условий вызывает изменение строго определенного признака);
• общность изменений (изменения признака одновременно у всех или большинства особей генетически однородной популяции);
• обратимость изменений (изменения не наследуются, после прекращения действия внешнего фактора исчезают).

В некоторых случаях у бактерий наблюдаются так называемые длительные модификации, когда изменение признака сохраняется в нескольких поколениях после прекращения действия фактора. Это обусловлено тем, что при делении клеток передаются не только структуры генотипа, но и содержимое клетки, частично сохранившее остатки веществ, образовавшихся в предыдущих условиях.

Рассмотрим пример модификационной изменчивости бактерий. При посеве разведенной культуры бактерий Proteus vulgaris на питательный агар через сутки выросли колонии бактерий, каждая из которых окружена зоной роения. После пересева колоний на питательный агар с желчью все колонии выросли через сутки без роения. После пересева этих колоний на исходный питательный агар все выросшие колонии вновь имели зоны роения.

Изменения фенотипа протея на среде с желчью следует считать модификацией, так как присутствует все три отличительных признака: определенность изменчивости (связь отсутствия роения с фактором - желчью), общность изменчивости (изменения у всех колоний популяции), обратимость (при отсутствии желчи в питательной среде возврат бактерий к исходному фенотипу).

Возможность модификационной изменчивости бактерий следует постоянно учитывать в практической работе микробиологов. Для точной систематики и идентификации бактерий следует строго соблюдать стандартные (унифицированные) условия изучения свойств бактерий (стандартные питательные среды, тесты, реактивы, температуру и другие условия культивирования).

Первоисточником новых генов в природе являются мутации. Общепринятого определения мутации нет. Мутация от лат. mutatio - изменение генетических структур, имеющихся в клетке в данный момент, которое стабильно наследуется. Различают две группы мутаций: хромосомные аберрации, включающие 3 типа (изменение числа наборов хромосом, изменение числа отдельных хромосом, перестройки хромосом) и генные мутации. У бактерии могут быть мутации типа перестройки хромосом и генные мутации. При этом перестройки хромосом осуществляются путем делений (выпадения фрагмента хромосомы), инверсии (поворота участка хромосомы на 180°), транспозиций (вставок в какое-либо место хромосом небольших фрагментов ДНК, например, инсерционных сегментов или транспозонов). Генные мутации бывают односайтовые (в одном участке гена) или многосайтовые. Для появления мутации в гене достаточно точечного изменения одной пары нуклеотидов. По направлению мутации могут быть прямые или обратные. Прямые мутации вызывают изменения признаков организма дикого типа; обратные мутации сопровождаются реверсией к дикому типу. Восстановление исходного фенотипа в результате обратной мутации в ином участке гена или в другом гене является супрессорной мутацией. Мутация, в результате которой изменяются два и более признаков организма, называется плейотропной. Различают также спонтанные и индуцированные мутации. Спонтанные мутации возникают самопроизвольно в том смысле, что они детерминированы, но мы не знаем конкретно их причин. Индуцированные мутации вызываются воздействием определенных мутагенных факторов. К ним относятся различные виды ионизирующих излучений, ультрафиолетовые лучи, химические мутагены.

Изменчивость по механизму мутаций характеризуют определенные отличительные признаки.

• 1. Наследственность.
• 2. Низкая частота (скорость) мутирования (у бактерий 1 х Ю 6 - 1 х Ю 7 , т.е. мутация у одной клетки из 1-10 млн). Способность давать мутации (мутабельность) подвержена влиянию генотипа. У бактерий мутабельность резко повышается, если они имеют особые гены - му- таторы. Например, у кишечной палочки обнаружены два гена-мутато- ра - mut Т, mut SI.
• 3. Ненаправленность изменчивости (т.е. неопределенность, неадекватность изменения признаков ввиду воздействующего фактора; один и тот же фактор вызывает различные мутации).

Экспериментами С. Лурия и М. Дельбрюка (флюктуационный тест), Ньюкомба (тест перераспределения) показано существование в исходных популяциях бактерий спонтанных мутантов, устойчивых к воздействующему фактору - фагу - еще до его воздействия. Методика отпечатков (реплик), разработанная Д. Ледербергом, позволила непосредственно выделять из популяции клеток мутанты до воздействия адекватного фактора или после воздействия мутагена - самые различные не адекватные по признакам.

Бактерии имеют особые системы репарации мутационных повреждений ДНК. Наиболее изучены системы: «фотореактивация», «темно- вая репарация», «репликативная репарация». «Фотореактивация» восстанавливает дефекты (тиминовые димеры) в ДНК, вызванные только ультрафиолетовыми лучами. При «темновой репарации» действует комплекс ферментов, восстанавливающий повреждение на одной нити ДНК путем вырезания поврежденного участка и синтеза на его месте второй нити комплементарного отрезка ДНК, замещающего дефект. Система «репликативной репарации» заменяет повреждения обеих нитей ДНК путем рекомбинации.

Другим механизмом наследственной изменчивости является обмен генетическим материалом между клетками популяций бактерий (по горизонтали). Он не создает новых элементарных признаков, но очень ускоряет создание организмов с новыми комбинациями признаков за счет перераспределения генов из разных геномов, что способствует быстрому приспособлению бактерий к условиям среды. Бактерии способны к широкому генетическому обмену между различными видами и родами, а также с бактериофагами и плазмидами. У бактерий выявлены три основные формы обмена генетическим материалом: трансформация, трансдукция, конъюгация (рис. 3.2, 3.3). Они различаются способом передачи генетического материала.

Трансформация характеризуется передачей клетке-реципиенту некоторых генов донора с помощью свободной ДНК, выделенной из генома донора. Трансформация может быть спонтанной или индуцированной. Спонтанная трансформация в естественных условиях проявляется в появлении рекомбинантов при смешивании генетически различающихся клеток. Она протекает за счет ДНК, выделяющейся клетками в окружающую среду при их лизисе или в результате активного выделения ДНК жизнеспособными клетками-донорами. Индуцированная (искусственная) трансформация происходит при добавлении к культуре бактерий очищенной ДНК, полученной из бакте- рий-доноров. Для успешной трансформации необходим ряд условий, относящихся к ДНК и бактериям-реципиентам. ДНК должна быть двухцепочечной, иметь фрагменты 3-5 х Ю 6 дальтон, быть частично или полностью гомологичной ДНК реципиента. Клетки реципиента должны обладать компетентностью, т.е. восприимчивостью, что имеет место только в определенный период жизненного цикла, обусловлено выделением клеткой особого белка «фактора компетентности» и специфическим изменением проницаемости клеточной стенки и мембраны. Процесс трансформации состоит из нескольких этапов: связывания ДНК на поверхности компетентного реципиента с «фактором компетентности», проникновения ДНК путем «втаскивания» в клетку, включения ДНК в хромосому бактерии-реципиента путем рекомбинации, экспрессии переданных генов. Эффективность генетической трансформации во много раз повышается, если смесь ДНК и трансформируемых клеток подвергнуть обработке электрическим импульсом (метод электротрансформации). В естественных условиях эффективность трансформации менее существенна, чем других форм передачи генетического материала. Клетки бактерий имеют механизм защиты генома от чужеродной ДНК - особые системы модификации и рестрикции. Эти системы защищают свою ДНК путем модификации (чаще путем ее метилирования) и разрушают чужеродную ДНК с помощью особых ферментов - рестрикционных эндонуклеаз. Частным вариантом трансформации является трансфекция, когда в клетку-реципиент, лишенную клеточной стенки, вносят ДНК бактериофага или плазмид.

Трансдукция - перенос генетического материала от клетки-донора клетке-реципиенту с помощью бактериофагов. Различают общую (неспецифическую) и специфическую трансдукцию. Механизм общей трансдукции состоит в том, что в процессе внутриклеточного размножения вирулентного фага в его головку может быть случайно включен вместо фаговой ДНК фрагмент бактериальной ДНК, равной подлине фаговой. Так возникают дефектные фаги, у которых вместо собственной геномной ДНК содержится фрагмент ДНК бактерии-донора. Такие фаги сохраняют инфекционные свойства. Они адсорбируются на бактериальной клетке, вводят в нее ДНК, но при этом размножения фага не происходит. В случае генетической рекомбинации привнесенного фагом фрагмента ДНК донора с хромосомой клетки- реципиента новый признак наследственно закрепляется. Таким образом, при общей трансдукции фаг является только пассивным переносчиком генетического материала.

Специфическую трансдукцию отличает перенос строго определенного фрагмента ДНК бактерии-донора умеренными бактериофагами. Как известно, умеренными называют такие бактериофаги, которые могут интегрировать в хромосому клетки бактерий, вызывая ее лизогенизацию. Интегрированный в хромосому бактерии-донора умеренный фаг (профаг) в определенных условиях выходит из хромосомы, «прихватывая» ближайшие участки ДНК хромосомы бактерии и оставляя часть своего генома. Возникает дефектный умеренный фаг, включивший в свой геном бактериальные гены бактерии-донора. Далее трансдуцируюший фаг вносит свою ДНК в клетку бактерии-реципиента, где она вместе с фрагментом ДНК бактерии-донора интегрируется в состав хромосомы реципиента. В последующем фаг может выйти из хромосомы реципиента, но переданные им гены бактерии- донора остаются у реципиента. Примером может служить умеренный бактериофаг лямбда (X), который всегда переносит оперон gal или oneрон bio. Специфическая и общая трансдукция низкочастотны (10 -4 - 10 -7 на 1 частицу фага). Частным вариантом специфической трансдук- ции является фаговая или лизогенная конверсия. Трансдуцирующий фаг, интегрируясь в хромосому реципиента, вызывает лизогенизацию бактерии и передает гены новых признаков, например, токсинообра- зования, дифтерийным бактериям. Однако гены, контролирующие новый признак, постоянно включены в геном таких трансдуциру- ющих фагов. Появление этих генов не связано с предварительным размножением фага на токсигенных донорах. Вероятно, фаг включил в геном эти гены на более ранних этапах своей эволюции. Такие трансдуцирующие фаги недефектны и вызывают фаговую конверсию с очень высокой частотой.

Конъюгация характеризуется переносом генетического материала путем непосредственного контакта между клетками. Этот процесс по- лярен - генетический материал передается только от бактерий-доно- ров к бактериям-реципиентам. Донорская функция клетки и процесс конъюгации контролируются генами конъюгационного переноса (tra- оперон), локализованными в конъюгативных плазмидах. Среди многих конъюгативных плазмид имеется плазмида F, контролирующая только указанные функции. В автономном, внехромосомном состоянии она обеспечивает донорский тип клетки F+ (мужская), образование полых ворсинок (F-пили) и свой собственный перенос в F- (женские) клетки реципиента. При этом хромосома донора не передается, а реципиенты, получившие плазмиду F, приобретают донорский тип F+. При интеграции плазмиды F в хромосому бактерии-хозяина образуются Hfr (high frequency of recombination) - штаммы бактерий с высокой частотой передачи хромосомных генов. Однако плазмида F обычно не переходит в клетку реципиента, так как находится на конце хромосомы, противоположном тому, с которого начинается ее переход.

Переход хромосомы через конъюгационный мостик между клетками через канал F-пили сопряжен с ее репликацией. При этом через мостик проходит только одна нить ДНК хромосомы, на которой в клетке реципиента синтезируется комплементарная вторая нить, и далее под контролем генов рекомбинации (гес А) хромосомы реципиента происходит интеграция переданного фрагмента ДНК в хромосому реципиента. Плазмида F может ревертировать у Hfr-штаммов в исходное внехромосомное состояние, захватив прилегающий участок бактериальной хромосомы. Таким способом формируется плазмида F’ (F-прим), несущая часть хромосомных генов бактерии-хозяина, например, плазмида F’ lac. Перенос генов донора в клетки реципиентов посредством плазмид F’ называется сексдукцией. При этом плазмида F’ переносит свой геном, содержащий и некоторые гены донора, с высокой частотой, а хромосома бактерии-донора не передается.

Перенос других видов конъюгативных плазмид (R, Ent, Col и др.) также происходит с высокой частотой. Следует отметить, что эффективный перенос плазмид путем конъюгации не знает «родственных» барьеров и происходит между бактериями различных видов и родов.

При любой форме обмена генетическим материалом заключительным этапом является рекомбинация между полученной ДНК и хромосомой клетки-реципиента. При переносе одной нити ДНК вначале происходит достраивание комплементарной ей нитью. Рекомбинируют между собой только двунитевые ДНК. Известны общая рекомбинация, сайт-специфическая рекомбинация и рекомбинация, контролируемая транспонируемыми элементами.

Общая рекомбинация происходит между гомологичными ДНК. Сайт-специфическая рекомбинация обусловлена наличием специфических участков у рекомбинируемых молекул ДНК, например, хромосомы Е. coli и умеренного бактериофага лямбда. Общая и сайт-специфическая рекомбинации контролируются геном гее А. Рекомбинации, осуществляемые транспонируемыми элементами, также сайт-специфичны и определяются особыми нуклеотидными последовательностями, однако не зависят от гее А гена. Ведущая роль в процессах рекомбинации у бактерий принадлежит гену гее А. Его продукт - белок Rec А (молекулярная масса 38 кД) обладает уникальными функциями: прочно связывается с одиночными нитями ДНК; способствует высвобождению разорванной нити из двойной спирали ДНК; удерживает вместе одиночную нить ДНК и двойную спираль ДНК; обладает свойством ДНК-зависимой АТФ-азы. Ген гес А участвует не только в процессе рекомбинации. Его продукт необходим для пострепликативной репарации, индукции профага, клеточного деления и других важных функций бактерий. Рецессивные мутации в таком гене отражаются на всех этих функциях, поэтому они получили название SOS-функций, а их совокупность представляет единую SOS-систему. Выражение любой SOS-функции зависит от активности продукта гена гес А. SOS-система срабатывает после любых повреждающих воздействий на ДНК. Поэтому ген гес А имеет основное значение в самозащите генетической системы бактерий.

Применение методов генетики для изучения генома бактерий позволило создать геносистематику бактерий. На ее основе существенно уточнена действующая классификация бактерий и созданы предпосылки разработки естественной систематики и классификации. В интересах систематики используют ряд методов. Метод гибридизации ДНК-ДНК (выявления уровня гомологии ДНК). Считается, что показатель 60-100% гомологии ДНК указывает на родство на уровне вида. Однако общепринятых критериев нет. Метод гибридизации ДНК с рРНК выявляет генетические связи между участком ДНК, контролирующим синтез рРНК, и нуклеотидами рРНК. Цистроны, ответственные за синтез рРНК, консервативны и позволяют выявить родственные связи на уровне рода, семейства. Наиболее надежным является метод секвенирования ДНК. Этот метод выявляет последовательность нуклеотидов в отдельных фрагментах ДНК или всей ДНК хромосомы. Лучшим объектом исследования (наиболее консервативным) является участок ДНК, контролирующий синтез 16S рибосомальной РНК бактерий. ДНК этого фрагмента клонируют, затем секвенируют. Метод секвенирования ДНК позволяет выявить родство бактерий на уровне царства, класса, семейства, рода, но недостаточно чувствителен для установления вида. Этот метод позволяет выявлять эволюционные связи бактерий и является основным в геносистематике. У наиболее важных бактерий изучена методом секвенирования полная последовательность нуклеотидов ДНК хромосомы (кишечная палочка, синегнойная палочка и др.).

Раскрыт генетический механизм весьма важной для медицины проблемы приобретенной лекарственной устойчивости бактерий.

Установлено, что основное значение в быстром формировании устойчивости бактерий к антибиотикам имеют R-плазмиды, несущие гены устойчивости к 1-10 антибиотикам в любых сочетаниях. Они могут передавать гены антибиотикорезистентности чувствительным бактериям за несколько минут, превращая в устойчивую всю популяцию бактерий в организме. До сих пор нет эффективных средств удаления R-плазмид или блокады их передачи. Пока реальным достижением является применение препаратов, блокирующих активность ферментов, разрушающих антибиотики, которые контролируются R-плазмидами. Например, для инактивации бета-лактамазы используют клавулано- вую кислоту, сульбактам, тазобактам в сочетании с антибиотиками бета-лактамной группы.

Установлен генетический контроль факторов патогенности бактерий. Показана возможность локализации этих генов в геномах бактерий, бактериофагов, плазмид. Выявлены механизмы формирования патогенных штаммов среди условно-патогенных бактерий. Эти сведения позволяют выявлять патогенные бактерии молекулярно-биологическими методами и целенаправленно получать авирулентные вакцинные штаммы микроорганизмов.

Крупным достижением генетики является разработка метода полимеразной цепной реакции (ПЦР), отмеченного Нобелевской премией (Мюллис К., 1993). На основе ПЦР создана принципиально новая универсальная система индикации микроорганизмов и диагностики инфекционных заболеваний - геноиндикация. Метод ПЦР позволяет амплифицировать («размножить», клонировать) in vitro определенные участки ДНК, за 2-4 ч получить миллионы копий этой ДНК. Сущность метода ПЦР составляет многократный циклический процесс, попеременно включающий в каждом цикле три этапа - тепловую денатурацию ДНК (плавление), ее отжиг (присоединение синтетических олигонуклеотидных праймеров), синтез (достраивание второй цепи ДНК термостабильной ДНК-полимеразой). Смена этих этапов происходит в результате изменения температуры реакционной смеси в специальном приборе амплификаторе (термоциклере). Денатурация исходной и последующих копий ДНК, ведущая к разделению ДНК на две одиночные цепи, происходит при 90-95 °С в течение 40- 50 сек. Отжиг (присоединение праймеров) происходит при температуре 40- 65 °С. Праймеры - синтетические олигонуклеотиды (20-30 нуклеотидов) - присоединяются к одноцепочечной ДНК-мишени, фланкируя искомый специфический фрагмент ДНК. Праймеры подбирают так, чтобы они ограничивали искомый фрагмент и были комплементарны противоположным цепям ДНК; при этом один праймер находится на одной цепи, другой - на противоположной. Синтез (элонгация) - достраивание второй цепи Д Н К происходит при 72 °С с участием Tag-ДНК-полимеразы. Достраивание второй нити ДНК идет с 5"-конца к З"-концу каждой нити ДНК, т.е. в противоположных направлениях. В результате первого цикла образуются две копии участка ДНК, ограниченного праймером. Длительность цикла составляет в зависимости от вида термоциклера 2-2 мин или 30-40 сек. В результате каждого последующего цикла количество синтезируемых копий удваивается в геометрической прогрессии (рис. 3.4). Обычно ПЦР включает 20-30 циклов, что обеспечивает синтез 1 млн копий искомого фрагмента ДНК.

Рис. 3.4.

Для детекции продуктов ПЦР применяется электрофорез или другие системы детекции.

ПЦР адаптирована для выявления большинства микроорганизмов, имеющих медицинское значение. Она позволяет быстро обнаружить искомый микроорганизм непосредственно в исследуемом материале без выявления чистой культуры, имеет высокую чувствительность (1 х Ю 1 - 1 х Ю 3 микроорганизмов в 1 г материала). ПЦР нашла широкое применение для обнаружения трудно культивируемых и медленно растущих микроорганизмов (вирусов, хламидий, риккетсий, микоплазм, спирохет, микобактерий).

Генетика бактерий и вирусов.

Формирование новых знаний. Лекционный блок

План изучения темы:

1. Генетический материал бактерий.

2. Классификация и биологическая роль плазмид.

3.Генетика вирусов

4. Биотехнология, генетическая инженерия.

5.Противомикробные препараты

Молекулярная биология, изучающая фундаментальные основы жизни, является в значительной степени детищем микробиологии. В качестве базовых объектов изучения в ней используют вирусы и бактерии, а основное направление - молекулярная генетика основана на генетике бактерий и фагов.

Бактерии - удобный материал для генетики. Их отличает :

Относительная простота генома (сопокупности нуклеотидов хромосом);

Гаплоидность (один набор генов), исключающая доминантность признаков;

Различные интегрированные в хромосомы и обособленные фрагменты ДНК;

Половая дифференциация в виде донорских и реципиентных клеток;

Легкость культивирования, быстрота накопления биомасс.

Общие представления о генетике.

Ген- уникальная структурная единица наследственности, носитель и хранитель жизни. Он имеет три фундаментальные функции.

1.Непрерывность наследственности - обеспечивается механизмом репликации ДНК.

2.Управление структурами и функциями организма - обеспечивается с помощью единого генетического кода из четырех оснований (А- аденин, Т- тимин, Г- гуанин, Ц- цитозин). Код триплетный, поскольку кодон - функциональная единица, кодирующая аминокислоту, состоит из трех оснований (букв).

3.Эволюция организмов - благодаря мутациям и генетическим рекомбинациям.

В узкоспециальном плане ген чаще всœего представляет структурную единицу ДНК, расположение кодонов в которой детерминирует первичную структуру соответствующей полипептидной цепи (белка). Хромосома состоит из особых функциональных единиц- оперонов.

Основные этапы развития (усложнения) генетической системы можно представить в виде следующей схемы:

кодон à ген à оперон à геном вирусов и плазмид à хромосома прокариот (нуклеоид) à хромосомы эукариот (ядро).

1.Ядерные структуры бактерий - хроматиновые тельца или нуклеоиды (хромосомная ДНК). У бактерий одна замкнутая кольцевидная хромосома (до 4 тысяч отдельных генов). Бактериальная клетка гаплоидна, а удвоение хромосомы (репликация ДНК) сопровождается делœением клетки. Вегетативная репликация хромосомной (и плазмидной) ДНК обусловливает передачу генетической информации по вертикали- от родительской клетки- к дочерней. Передача генетической информации по горизонтали осуществляется различными механизмами - в результате конъюгации, трансдукции, трансформации, сексдукции.

2.Внехромосомные молекулы ДНК представлены плазмидами, мигрирующими генетическими элементами - транспозонами и инсервационными (вставочными) или IS- последовательностями.

Плазмиды- экстрахромосомный генетический материал (ДНК), более просто устроенные по сравнению с вирусами организмы, наделяющие бактерии дополнительными полезными свойствами. По молекулярной массе плазмиды значительно меньше хромосомной ДНК, содержат от 40 до 50 генов.

Их выделœение в отдельный класс определяется существенными отличиями от вирусов.

1.Среда их обитания - только бактерии (среди вирусов, кроме вирусов бактерий- бактериофагов имеются вирусы растений и животных).

2.Плазмиды сосуществуют с бактериями, наделяя их дополнительными свойствами. У вирусов эти свойства бывают только у умеренных фагов при лизогении бактерий, чаще же всœего вирусы вызывают отрицательный последствия, лизис клеток.

3.Геном представлен двунитевой ДНК.

4.Плазмиды представляют из себя"голые" геномы, не имеющие никакой оболочки, их репликация не требует синтеза структурных белков и процессов самосборки.

Плазмиды могут распространяться по вертикали (при клеточном делœении) и по горизонтали, прежде всœего путем конъюгационного переноса. Учитывая зависимость отналичия или отсутствия механизма самопереноса (его контролируют гены tra- оперона) выделяют конъюгативные и неконъюгативные плазмиды. Плазмиды могут встраиваться в хромосому бактерий- интегративные плазмиды или находиться в виде отдельной структуры- автономные плазмиды (эписомы).

Генетический материал бактерий. - понятие и виды. Классификация и особенности категории "Генетический материал бактерий." 2017, 2018.

Молекулярная биология, изучающая фундаментальные основы жизни, является в значительной степени детищем микробиологии. В качестве основных объектов изучения в ней используют вирусы и бактерии, а основное направление- молекулярная генетика основана на генетике бактерий и фагов.

Бактерии - удобный материал для генетики. Их отличает:

Относительная простота генома (совокупности нуклеотидов хромосом);

Гаплоидность (один набор генов), исключающая доминантность признаков;

Различные интегрированные в хромосомы и обособленные фрагменты ДНК;

Половая дифференциация в виде донорских и реципиентных клеток;

Легкость культивирования, быстрота накопления биомасс.

Общие представления о генетике.

Ген - уникальная структурная единица наследственности, носитель и хранитель жизни. Он имеет три фундаментальные функции.

1.Непрерывность наследственности - обеспечивается механизмом репликации ДНК.

2.Управление структурами и функциями организма - обеспечивается с помощью единого генетического кода из четырех оснований (А - аденин, Т - тимин, Г - гуанин, Ц - цитозин). Код триплетный, поскольку кодон- функциональная единица, кодирующая аминокислоту, состоит из трех оснований (букв).

3.Эволюция организмов - благодаря мутациям и генетическим рекомбинациям.

В узкоспециальном плане ген чаще всего представляет структурную единицу ДНК, расположение кодонов в которой детерминирует первичную структуру соответствующей полипептидной цепи (белка). Хромосома состоит из особых функциональных единиц - оперонов .

Основные этапы развития (усложнения) генетической системы можно представить в виде следующей схемы:

кодон à ген à оперон à геном вирусов и плазмид à хромосома прокариот (нуклеоид) à хромосомы эукариот (ядро).

Генетический материал бактерий.

1.Ядерные структуры бактерий - хроматиновые тельца или нуклеоиды (хромосомная ДНК). У бактерий одна замкнутая кольцевидная хромосома (до 4 тысяч отдельных генов). Бактериальная клетка гаплоидна, а удвоение хромосомы (репликация ДНК) сопровождается делением клетки. Вегетативная репликация хромосомной (и плазмидной) ДНК обусловливает передачу генетической информации по вертикали - от родительской клетки- к дочерней. Передача генетической информации по горизонтали осуществляется различными механизмами - в результате конъюгации, трансдукции, трансформации, сексдукции.

2.Внехромосомные молекулы ДНК представлены плазмидами , мигрирующими генетическими элементами - транспозонами и инсервационными (вставочными) или IS- последовательностями.

Плазмиды - экстрахромосомный генетический материал (ДНК), более просто устроенные по сравнению с вирусами организмы, наделяющие бактерии дополнительными полезными свойствами. По молекулярной массе плазмиды значительно меньше хромосомной ДНК, содержат от 40 до 50 генов.

Их выделение в отдельный класс определяется существенными отличиями от вирусов.

1.Среда их обитания - только бактерии (среди вирусов, кроме вирусов бактерий- бактериофагов имеются вирусы растений и животных).

2.Плазмиды сосуществуют с бактериями, наделяя их дополнительными свойствами. У вирусов эти свойства могут быть только у умеренных фагов при лизогении бактерий, чаще же всего вирусы вызывают отрицательный последствия, лизис клеток.

3.Геном представлен двунитевой ДНК.

4.Плазмиды представляют собой “голые” геномы, не имеющие никакой оболочки, их репликация не требует синтеза структурных белков и процессов самосборки.

Плазмиды могут распространяться по вертикали (при клеточном делении) и по горизонтали, прежде всего путем конъюгационного переноса. В зависимости от наличия или отсутствия механизма самопереноса (его контролируют гены tra- оперона) выделяют конъюгативные и неконъюгативные плазмиды. Плазмиды могут встраиваться в хромосому бактерий - интегративные плазмиды или находиться в виде отдельной структуры- автономные плазмиды (эписомы) .

Классификация и биологическая роль плазмид.

Функциональная классификация плазмид основана на свойствах, которыми они наделяют бактерии. Среди них - способность продуцировать экзотоксины и ферменты, устойчивость к лекарственным препаратам, синтез бактериоцинов.

1.F- плазмиды - донорские функции, индуцируют деление (от fertility - плодовитость). Интегрированные F - плазмиды- Hfr- плазмиды (высокой частоты рекомбинаций).

2.R- плазмиды (resistance) - устойчивость к лекарственным препаратам.

3.Col- плазмиды - синтез колицинов (бактериоцинов)- факторов конкуренции близкородственных бактерий (антогонизм). На этом свойстве основано колицинотипирование штаммов.

4.Hly- плазмиды - синтез гемолизинов.

5.Ent- плазмиды - синтез энтеротоксинов.

6.Tox- плазмиды - токсинообразование.

Близкородственные плазмиды не способны стабильно сосуществовать, что позволило объединить их по степени родства в Inc- группы (incompatibility- несовместимость).

Биологическая роль плазмид многообразна, в том числе:

Контроль генетического обмена бактерий;

Контроль синтеза факторов патогенности;

Совершенствование защиты бактерий.

Бактерии для плазмид - среда обитания, плазмиды для них- переносимые между ними дополнительные геномы с наборами генов, благоприятствующих сохранению бактерий в природе.

Мигрирующие генетические элементы - отдельные участки ДНК, способные определять свой перенос между хромосомами или хромосомой и плазмидой с помощью фермента рекомбинации транспозазы. Простейшим их типом являются инсерционные последовательности (IS- элементы ) или вставочные элементы, несущие только один ген транспозазы, с помощью которой IS- элементы могут встраиваться в различные участки хромосомы. Их функции- координация взаимодействия плазмид, умеренных фагов, транспозонов и генофора для обеспечения репродукции, регуляция активности генов, индукция мутаций. Величина IS- элементов не превышает 1500 пар оснований.

Транспозоны (Tn- элементы) включают до 25 тысяч пар нуклеотидов, содержат фрагмент ДНК, несущий специфические гены, и два Is- элемента. Каждый транспозон содержит гены, привносящие важные для бактерии характеристики, как и плазмиды (множественная устойчивость к антибиотикам, токсинообразование и т.д.). Транспозоны- самоинтегрирующиеся фрагменты ДНК, могут встраиваться и перемещаться среди хромосом, плазмид, умеренных фагов, т.е. обладают потенциальной способностью распространяться среди различных видов бактерий.

Наследственный аппарат бактерий

Важнейшими признаками живых организмов являются измен­чивость и наследственность.

Основу наследственного аппарата бактерий, как и всех других организмов, составляет ДНК (у РНК-содержащих вирусов - РНК).

Наряду с этим наследственный аппарат бактерий и возможно­сти его изучения имеют ряд особенностей:

бактерии - гаплоидные организмы, т. е. они имеют 1 хромосому. В связи с этим при наследовании признаков отсутствует явле­ние доминантности;

• бактерии обладают высокой скоростью размножения, в связи с чем за короткий промежуток времени (сутки) сменяется не­сколько десятков поколений бактерий. Это дает возможность изучать огромные по численности популяции и достаточно легко выявлять даже редкие по частоте мутации. Наследственный аппарат бактерий представлен хромосомой. У бактерий она одна. Если и встречаются клетки с 2, 4 хромо­сомами, то они одинаковые.

Хромосома бактерий - это молекула ДНК. Длина этой молеку­лы достигает 1,0 мм и, чтобы «уместиться» в бактериальной клетке, она не линейная, как у эукариотов, а суперспирализо-вана в петли и свернута в кольцо. Это кольцо в одной точке прикреплено к цитоплазматической мембране. На бактериальной хромосоме располагаются отдельные гены. У кишечной палочки, например, их более 2 тыс.

Функциональные единицы генома

Генотип (геном) бактерий

представлен не только хромосом­ными генами. Функциональными единицами генома бактерий, кроме хромосомных генов, являются:

• IS-последовательности;
• транспозоны;
• плазмиды.

IS-последовательности

Короткие фрагменты ДНК. Они не несут структурных (кодирующих тот или иной белок) генов, а содержат только гены, ответственные за транспозицию (спо­собность IS-последовательностей перемещаться по хромосоме и встраиваться в различные ее участки). IS-последовательности одинаковы у разных бактерий. Транспозоны - это молекулы ДНК, более крупные, чем IS-после­довательности. Помимо генов, ответственных за транспози­цию, они содержат и структурный ген, кодирующий тот или иной признак.

Транспозоны легко перемещаются по хромосоме. Их положе­ние сказывается на экспрессии как их собственных структур­ных генов, так и соседних хромосомных. Транспозоны могут существовать и вне хромосомы, автономно, но неспособны к автономной репликации.

Плазмиды

Кольцевые суперспиралевидные молекулы ДНК. Их молекулярная масса колеблется в широких пределах и может быть в сотни раз больше, чем у транспозонов.

• R-плазмиды - лекарственной устойчивостью;
• Col-плазмиды - способностью синтезировать колицины;
• F-плазмиды - передавать генетическую информацию;
• Шу-плазмиды - синтезировать гемолизин;
• Тох-плазмиды - синтезировать токсин;
• плазмиды биодеградации - разрушать тот или иной субстрат и т. д.

Плазмиды могут быть интегрированы в хромосому (в отличие от IS-последовательностей и транспозонов, встраиваются в строго определенные участки), а могут существовать автономно. В этом.случае они обладают способностью к автономной репликации, и именно поэтому в клетке может быть 2, 4, 8 копий такой плазмиды.

Многие плазмиды имеют в своем составе гены трансмиссивности и способны передаваться от одной клетки к другой при конъюгации (обмене генетической информацией). Такие плаз­миды называются трансмиссивными.

Фактор фсртильности

Наличие F-плазмиды (фактор фертилъности, половой фактор)

придает бактериям функции донора, и такие клетки способны передавать свою генетическую информацию другим, F-клеткам. Можно сказать, что наличие F-плазмиды является фенотипиче-ским выражением (проявлением) пола у бактерий: с F-плазмидой связана не только донорская функция, но и некоторые другие фенотипические признаки - наличие F-пилей (половых ресничек) и чувствительность к L-фагам. С помощью F-ресничек устанавливается контакт между донорскими и реципиентными клетками. Через их канал и передается донорская ДНК при рекомбинации. На половых ресничках расположены ре­цепторы для мужских fj-фагов. F-клетки не имеют таких ре­цепторов и нечувствительны к таким фагам.

Изменчивость бактериальной клетки

У бактерий различают 2 вида изменчивости - фенотипическую и генотипическую.

Фенотипическая изменчивость - модификация - не затрагива­ет генотип, но затрагивает большинство особей популяции. Модификации не передаются по наследству и с течением вре­мени затухают, т. е. возвращаются к исходному фенотипу через большее (длительные модификации) или меньшее (кратковре­менные модификации) число поколений.

Генотипическая изменчивость затрагивает генотип. В ее осно­ве лежат мутации и рекомбинации.

Мутации бактерий принципиально не отличаются от мутаций эукариотических клеток. Особенностью мутаций у бактерий является относительная легкость их выявления, так как имеется возможность работать с большими по численности популя­циями бактерий. По происхождению мутаиии могут быть:

• спонтанными;
• индуцированными. По протяженности:
• точечными;
• генными;
• хромосомными. По направленности:

— прямыми;

— обратными.

Рекомбинации (обмен генетическим материалом) у бактерий отличаются от рекомбинаций у эукариот:

• у бактерий имеется несколько механизмов рекомбинаций;
• при рекомбинациях у бактерий образуется не зигота, как у эу­кариот, а мерозигота (несет полностью генетическую инфор­мацию реципиента и часть генетической информации донора в виде дополнения);
• у бактериальной клетки-рекомбината изменяется не только качество, но и количество генетической информации. Трансформация - это обмен генетической информацией у бакте­рий путем введения в бактериальную клетку-реципиент готового препарата ДНК (специально приготовленного или непосредст­венно выделенного из клетки-до нора). Чаще всего передача генетической информации происходит при культивировании реципиента на питательной среде, содержащей ДНК донора. Для восприятия донорской ДНК при трансформации клетка-реципиент должна находиться в определенном физиологиче­ском состоянии (компетентности), которое достигается специ­альными методами обработки бактериальной популяции.

При трансформации передаются единичные (чаще 1) признаки. Трансформация является самым объективным свидетельством связи ДНК или ее фрагментов с тем или иным фенотипическим признаком, поскольку в реципиентную клетку вводится чистый препарат ДНК.

Трансдукция

Обмен генетической информацией у бактерий пу­тем передачи ее от донора к реципиенту с помощью умеренных (трансдуцирующих) бактериофагов.

Трансдуцирующие фаги могут переносить 1 или более генов (признаков). Трансдукиия бывает:

• специфической - переносится всегда один и тот же ген;
• неспецифической - передаются разные гены.

Это связано с локализацией трансдуиируюших фагов в геноме до­нора:

• в случае специфической трансдукции они располагаются все­гда в одном месте хромосомы;
• при неспецифической их локализация непостоянна. Конъюгация - обмен генетической информацией у бактерий пу­тем передачи ее от донора к реципиенту при их прямом контакте. После образования между донором и реципиентом конъюга-ционного мостика одна нить ДНК-донора поступает по нему в клетку-реципиент. Чем дольше контакт, тем большая часть до­норской ДНК может быть передана реципиенту.

Основываясь на прерывании конъюгации через определенные промежутки времени, можно определить порядок расположе­ния генов на хромосоме бактерий - построить хромосомные карты бактерий (произвести картирование бактерий).

Донорской функцией обладают F + -клетки.

Генетика микроорганизмов как наука

Замечание 1

Примерно до конца $30$-х годов $XX$ века считалось, что микроорганизмы не имеют ядерного аппарата. Поэтому вопросы наследственности и изменчивости микроорганизмов тщательно не изучались.

Лишь с изобретением электронного микроскопа появилась возможность рассмотреть субмикроскопическую структуру клетки вообще и микроорганизмов в частности.

С начала $40$-х годов ученые-генетики обращают свое внимание на микроорганизмы. Бактерии, микроскопические грибы и вирусы становятся объектами генетических исследований. Формируется новая отрасль микробиологии – генетика микроорганизмов.

Генетика микроорганизмов – это раздел общей генетики, в котором предметом изучения служат микроорганизмы (бактерии, вирусы, микроскопические грибы) и особенности их наследственности и изменчивости.

Характерной особенностью микроорганизмов является гаплоидный набор хромосом или кольцевая молекула ДНК. Это дает возможность мутациям проявиться уже в первом поколении потомков.

Начало микробиологических генетических исследований

Благодаря изучению субмикроскопической структуры клеток микроорганизмов удалось найти ответы на многие вопросы генетики. Американсие генетики О.Т. Эйвери, К. Мак-Леод и М. Маккарти, проводя опыты на пневмококках, получили первые доказательства того, что материальным носителем наследственности является молекула ДНК. Исследования хлебной плесени позволило сформулировать положение, что один ген программирует синтез одной полипептидной цепи (одногобелка).

Но особенно интенсивно стали исследовать микроорганизмы с точки зрения генетики после того, как американскими микробиологами С. Лурия и М. Дельброком на примере кишечной палочки было доказано универсальность закономерностей мутационного процесса. Они доказали, что и бактерии подчиняются мутационным закономерностям.

В науке появился новый принцип изучения изменчивости у бактерий – клональный анализ. Он заключается в тщательном исследовании потомства одной клетки. Эта клетка становится родоначальником клона.

Изучение бактерий

В результате кропотливых исследований американским генетикам Дж. И Э. Ледербергам удалось доказать, что у бактерий мутации возникают независимо от условий их культивирования. Они разработали метод отпечатков, который позволил очень упростить приемы отбора микроорганизмов с желаемыми свойствами для дальнейших исследований. Они доказали, что больших популяциях клеток бактерий мутации происходят неупорядочено – спонтанно.

В $1946$ году было доказано, что бактериям тоже присущ половой процесс, были открыты явления конъюгации хромосом и рекомбинации генов, переноса генетической информации от одной бактериальной клетки к другой при посредстве бактериофага.

Существует мнение, что в кольцевой молекуле нуклеиновой кислоты клеток прокариот «прочтение информации» зависит от места начала «считывания». В зависимости от того, с какого нуклеотида начался этот процесс, находится и синтез того или иного белка.

Изучение фагов

Изучая особенности взаимоотношений «бактерия – бактериофаг», американские генетики открыли явление трансдукции (переноса генов между бактериальными клетками с помощью фагов) и обнаружили рекомбинацию у фагов. Это дало возможность изучать вопросы наследственности на уровне молекул (молекулярный уровень организации материи).

Немецкие микробиологи исследовали молекулу РНК. Для каждой из групп микроорганизмов была разработана методика исследований.

Генетика грибов и водорослей

Низшие грибы и водоросли имеют половой процесс несколько отличный от полового процесса других организмов. Благодаря их изучению появился новый метод – тетрадный анализ. Исследуя эти организмы, ученые разрабатывали методику объединения ядер генетически различных штаммов микроорганизмов. Все эти методы могут в дальнейшем послужить для выведения организмов с заданными качествами, для разработки новых поколений антибиотиков и биологически активных веществ, а также для борьбы со многими видами заболеваний растений, животных и, конечно же, человека.

Замечание 2

Но вопросы генной инженерии требуют осторожного подхода к изучению и применению полученной информации на практике. Ведь не ясно, к каким последствиям может привести появление генетически модифицированных организмов в природе и в человеческом организме.